Investigación Cromatografía Líquida Multidimensional

Mi línea principal de investigación se dedica a la Cromatografía Líquida Multidimensional, es decir, acoplando dos o más columnas, fundamentalmente en el campo del análisis de residuos de plaguicidas en muestras de aguas, suelos y productos vegetales.

A continuación, se presenta información sobre Técnicas Cromatográficas Acopladas, para posteriormente proponer a modo de ejemplo algunas aplicaciones en el campo del análisis de plaguicidas en muestras de agua.

TECNICAS CROMATOGRAFICAS ACOPLADAS
La cromatografía multidimensional hace uso de dos o más columnas acopladas para conseguir separaciones no alcanzables con un único sistema. Se define esta técnica como un proceso de separación en el que una muestra es sometida a una secuencia de separaciones, cada una de las cuales actúa sobre el todo o parte de los componentes separados en una etapa previa cromatográfica, que difieren en su selectividad relativa y/o capacidad.

En las técnicas cromatográficas acopladas se efectúa una preseparación de la muestra en una primera columna cromatográfica; posteriormente, una parte muy pequeña de la muestra conteniendo los analitos se transfiere "on-line" por medio de una interfase hacia la segunda columna cromatográfica en la que tiene lugar la separación de los mismos.

Las técnicas cromatográficas acopladas se encuentran entre las técnicas más sensibles y selectivas disponibles para la determinación de residuos de pesticidas en muestras medioambientales. Las más utilizadas en la actualidad en ARP son la cromatografía líquida acoplada a cromatografía líquida (CL-CL) también denominada CL con "column switching", y la cromatografía líquida acoplada a cromatografía de gases capilar (CL-CG).

En la Figura 1 se muestra un esquema básico de una técnica cromatográfica acoplada.

M-1 y M-2 fases moviles. AS sistema de inyección o autoinyector. C-1 y C-2 primera y segunda columna. I interfase. I1 e I2 interferentes de la muestra. A analitos de interés. D sistema de detección.
 
 

· Introducción de un volumen de muestra relativamente grande en la primera columna del sistema, mejorando, de este modo, la sensibilidad global del procedimiento analítico. En combinación con una apropiada compresión de pico durante la etapa de transferencia (tercera etapa) los volúmenes de inyección pueden aumentarse desde microlitros hasta mililitros, pudiendo mejorar la sensibilidad en varios órdenes de magnitud.

· Preseparación de una gran parte de los interferentes de la muestra de los analitos de interés en la primera columna, mejorando la selectividad del procedimiento al descartar la mayor parte de los interferentes. Para mejorar lo más posible la selectividad es importante que el mecanismo de separación de ambas columnas difiera considerablemente. Esto se puede conseguir fácilmente acoplando CL con CG, pero es menos obvio en acoplamiento CL-CL.

· Transferencia de la fracción de interés a la segunda parte del sistema de separación por medio de una técnica de compresión de pico, de modo que aumente tanto la selectividad, minimizando el volumen de transferencia, como la sensibilidad, mejorando la forma del pico cromatográfico. Para la interconexión entre ambas columnas de separación, se necesita generalmente un método de focalización del pico. En CL-CG se usa generalmente una tecnica de focalización por enfriamiento (cold trapping), mientras que en CL-CL se consigue la compresión de pico utilizando gradientes escalonados durante la transferencia de los analitos desde la primera a la segunda columna.

· Análisis de la muestra transferida a la segunda columna realizándose una separación y detección convencional de los analitos de interés, despues de haber eliminado la mayor parte de los interferentes.
 
 

La aplicación de estas técnicas en el desarrollo de MMR para ARP resulta, a veces, problemática debido a su elevada selectividad. La heterogeneidad de los pesticidas, desde el punto de vista químico, y por consiguiente cromatográfico, hace difícil la aplicación de las cuatro etapas indicadas en un amplio grupo de compuestos.

A continuación, se comentan brevemente las técnicas acopladas más importantes.

Cromatografía de Gases - Cromatografía de Gases (CG-CG).

Los primeros procedimientos de acoplamiento de dos columnas de CG se llevaron a cabo al principio de los 70 (Schomburg y Ziegler, 1972; Schomburg et al., 1974). Sin embargo, actualmente apenas hay aplicaciones de esta técnica en ARP, quizás debido, en parte, a la introducción de la CG capilar.

Existen algunas aplicaciones CG-CG para la determinación de microcontaminantes orgánicos que presentan serios problemas de separación debido a sus propiedades muy semejantes, como bifenilos policlorados (PCB) y dioxinas (Schomburg et al., 1985).

Probablemente su uso en el futuro se dirija a la separación de pesticidas ópticamente activos, acoplando columnas no quirales a columnas quirales (Borwitzky y Schomburg, 1982).
 
 

Cromatografía Líquida - Cromatografía de Gases (CL-CG).

El acoplamiento CL-CG, que se introdujo hace más de una década (Majors, 1980), se ha convertido en una técnica común para la determinación de contaminantes en una gran variedad de matrices. La aparición de una interfase que permite la transferencia de grandes volúmenes de disolventes orgánicos apolares desde un cromatógrafo de líquidos a un cromatógrafo de gases capilar, ha favorecido el desarrollo de numerosas aplicaciones CL-CG en el análisis de alimentos y muestras medioambientales (Grob, 1991). Actualmente, se utilizan dos técnicas de transferencia:

1) Técnicas de columna vacía (retention gap) que emplean un inyector on-column (Grob, 1982). Se desarrollaron para evitar la distorsión de picos por ensanchamiento de bandas (flooding effect), debido al flujo de la muestra líquida hacia el interior de la columna de gases (Grob, 1981). Una entrada en el cromatógrafo de gases formada por una columna libre de fase estacionaria y, por consiguiente, con muy poco poder de retención, permite la reconcentración de grandes bandas iniciales a la entrada de la columna analítica. Esto permite la inyección de grandes volúmenes de muestra siempre que se disponga de una columna vacía de suficiente longitud. Posteriormente (Munari et al., 1985), se desarrolló una variante de la técnica de columna vacía, que hace uso de la evaporación parcial del eluyente del cromatógrafo líquido durante la introducción del mismo en la precolumna de cromatógrafo de gases sin relleno, lo cual permite la introducción de mayores volúmenes de muestra y el uso de precolumnas más cortas. Poco después (Grob et al., 1986a), aplicó la evaporación simultánea de disolvente (concurrent solvent evaporation), en donde todo el eluyente del cromatógrafo líquido es evaporado durante la transferencia al cromatógrafo de gases, permitiendo la introducción de fracciones teóricamente de volumen ilimitado, aunque la pérdida del frente de disolvente produce un ensanchamiento de los picos de los compuestos más volátiles.

2) Evaporación simultánea del disolvente por medio de la llamada interfase tipo "loop". El uso de la interfase anterior para transferir grandes fracciones de eluyente tienen dos desventajas claras: la primera es que los tiempos de transferencia de grandes volúmenes son largos debido al paso lento de los grandes volúmenes de vapores de disolvente a través de la columna de CG capilar. La segunda, es que el ajuste de condiciones que permitan una evaporación simultánea global del disolvente se hace más difícil.

La introducción de una interfase tipo "loop" junto con un suministro de gas portador con flujo controlado (Grob y Stoll, 1986b) simplifica enormemente la transferencia y acorta los tiempos de evaporación de disolvente.

Estas ventajas hacen que la mayoría de las aplicaciones CL-CG se lleven a cabo mediante evaporación simultánea de disolvente e interfase tipo "loop". Sin embargo, la evaporación parcial simultánea de disolvente e interfase tipo "on-column" sigue siendo el método de elección si se deben analizar compuestos volátiles.
 
 

Es interesante hacer notar que una de las primeras aplicaciones del acoplamiento CL-CG trata de la determinación del herbicida atrazina (Majors, 1980). Otros ejemplos de aplicaciones CL-CG en ARP son el análisis del pesticida experimental CGA 80000 en tejidos biológicos por CL-CG-ECD (Mostert y Ramsteiner, 1989); la determinación de dicamba y otros herbicidas ácidos en hojas de tabaco mediante derivatización seguida de CL-CG (Häkkinen et al., 1989) y varias determinaciones de pesticidas organoclorados y PCBs en varios tipos de muestras (Maris et al., 1988; Grob et al., 1987)

El potencial del acoplamiento CL-CG reside principalmente en su gran selectividad. Numerosos procedimientos analíticos incluyen una preseparación o purificación de la muestra mediante CL "off-line". La elevada eficacia obtenida por la CL permite la preseparación de grupos de compuestos muy semejantes, así como una purificación en el análisis de trazas en matrices altamente complejas, donde es necesario aislar los compuestos de interés de la gran cantidad de interferentes, como ocurre en ARP.

Sin embargo, esta elevada selectividad no siempre es favorable en el desarrollo de MMR, por lo que sistemas de separación con menor poder de resolución son a veces más adecuados para acoplarlos a CG que sistemas con elevada capacidad de separación. Esta aproximación se ha comprobado satisfactoriamente utilizando un sistema automático de EFS (ASPEC) acoplado a un cromatógrafo de gases capilar para la determinación de piretroides en aguas superficiales (van der Hoff et al., 1991).
 
 

Cromatografía Líquida - Cromatografía Líquida (CL-CL).

La primera aplicación de CL con columnas acopladas se propuso en 1973 (Huber y vd Linden, 1973). Actualmente, se realizan dos modos diferentes de acoplamiento: con precolumna enriquecedora (trace enrichment) (PC-CL) y con columnas acopladas (CL-CL).

PC-CL.

La aparición de PC-CL en fase reversa para el análisis directo de muestras acuosas (van Vliet et al., 1979; de Jong, 1980; Roth et al., 1981) produjo una proliferación de aplicaciones de la técnica de "column-switching", especialmente en el campo del análisis biomédico, ya que, además del análisis automatizado, proporcionaba un satisfactorio enriquecimiento de los analitos, reemplazando a las etapas de concentración por extracción líquido-líquido o por extracción en fase sólida manual. Para ese tipo de muestras se obtenía suficiente sensibilidad con la inyección directa de 0.1-0.5 ml de muestra; sin embargo, para el análisis de contaminantes en muestras acuosas a nivel de sub-ppb se requiere la inyección de volúmenes de muestra entre 50-500 ml, que se deben suministrar mediante una bomba de CL. Esta última aproximación se ha aplicado ampliamente para la determinación de residuos de contaminantes en muestras acuosas (Goewie et al., 1981, 1984; Maris et al., 1985; Nielen et al., 1985, 1986, 1987; Subra et al., 1988; Geerdink et al., 1989; Marvin et al., 1990; Brouwer et al., 1990, 1991, 1992; Hennion et al., 1991; Coquart y Hennion, 1991; Liska et al., 1992; Reupert et al., 1992).

En la mayoría de las aplicaciones, las precolumnas utilizadas presentan unas dimensiones entre 5-10 mm x 2-4.6 mm d.i.. Estos pequeños tamaños reducen el coste, permiten un muestreo rápido y previenen el ensanchamiento de bandas durante la transferencia del analito a la columna analítica. Generalmente, se empaquetan con rellenos de 10-40 mm de tamaño de partícula, en lugar de 3-10 mm, para prevenir la obturación durante el análisis.

Sin embargo, mediante esta técnica la selectividad sólo mejora ligeramente. Se ha investigado el uso de fases estacionarias más selectivas como intercambiadores iónicos o fases con metales para el enriquecimiento y purificación de las muestras (Slobodnik et al., 1992).

CL-CL.

En un intento de mejorar la selectividad de la CL con "column switching", la pequeña precolumna se ha ampliado a las dimensiones de una auténtica columna separadora, lo cual permite llevar a cabo una separación cromatográfica completa, más que una etapa de enriquecimiento (Figura 2).

Por otro lado, la combinación de dos columnas de separación que contengan fases estacionarias con similar selectividad, también parece una buena aproximación. Este sistema es fácil de montar, y ya en 1976 se propuso un sistema CL-CL en fase normal para la purificación "on-line" de pesticidas organoclorados en extractos lácteos (Dolphin et al., 1976), que posteriormente se automatizó (Hogendoorn et al., 1989a).

La CL-CL es una técnica muy adecuada para la determinación selectiva de un número limitado de analitos presentes en una matriz compleja. El aislamiento de una fracción apropiada de la primera columna y su transferencia a la segunda, proporciona generalmente la selectividad requerida en el análisis de trazas.

Recientemente se han desarrollado algunas aplicaciones para la determinación de pesticidas polares en diferentes matrices utilizando CL-CL (Goewie y Hogendoorn, 1985, 1987a, 1987b; Hogendoorn y Goewie, 1988, 1989b; Hogendoorn y van Zoonen, 1990a, 1991c, 1992b; Hogendoorn et al., 1990b, 1991a, 1991b, 1992a, 1993b).

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