CLCL

Cromatografía Líquida-Cromatografía Líquida

Introducción. Etapas del análisis.
Selección de las condiciones del acoplamiento.
Ventajas y limitaciones del acoplamiento CL-CL.
Aplicaciones del acoplamiento CL-CL.

Introducción. Etapas del análisis.

Como se ha comentado anteriormente, una de las características importantes de la CL es la capacidad de aplicar la técnicas de columnas acopladas ("column-switching"), que ofrece la posibilidad de integrar la preparación de la muestra y la purificación de la misma en el procedimiento cromatográfico. Las primeras aplicaciones sobre ARP con "column-switching" se centraron en la preconcentración de analitos en muestras acuosas (van Vliet et al., 1979; Goewie et al., 1981, 1984). Para estas aplicaciones se utilizaron precolumnas de longitud entre 2-10 mm con d.i. entre 2-3 mm, rellenas con partículas C18 de 5-10 mm, que resultaron adecuadas con respecto a la capacidad de carga y resolución (Goewie et al., 1984). Con este diseño, se evitan las extracciones manuales, pero se limita el campo de aplicación a muestras acuosas.

Debido a su bajo poder de separación, estas pequeñas precolumnas son poco adecuadas para llevar a cabo la purificación, ya que no pueden proporcionar suficiente separación entre analitos e interferentes de la muestra.

Hogendoorn y Goewie (1988) establecieron que el uso de (pre)columnas más largas en combinación con procedimientos de extracción "off-line" producía un considerable aumento en la selectividad de la técnica de "column-switching", que ahora podemos denominar más correctamente, acoplamiento CL-CL, ya que la primera columna es verdaderamente una columna separadora, y no sólo enriquecedora.

En la Figura 1 se muestra un sistema básico de acoplamiento CL-CL.

Figura 1. Representación esquemática de un acoplamiento CL-CL.

C-1 y C-2 primera y segunda columna separadora; AS autoinyector; I1 e I2 interferentes de la muestra (de cabeza y de cola, respectivamente); A fracción de analito; M-1 fase móvil para la purificación en C-1 (eliminación de I1); M-1b eluyente fuerte (eliminación de I2); M-2 fase móvil de C-2; HP válvula de alta presión de 6 vías; D detector.

Cualquier procedimiento de acoplamiento CL-CL se encuentra diferenciado en cuatro etapas:

1) Inyección (Figura 2A). Durante esta etapa se toma la muestra de agua o el extracto obtenido y se carga en el "loop" del autoinyector, mientras la fase móvil M-1 circula por la columna C-1, y la fase móvil M-2 por C-2. Se activa la válvula del autoinyector y comienza el análisis, pasando a la etapa de purificación.

2) Purificación (Figura 2B). Durante esta etapa se realiza una purificación de la muestra o extracto con un cierto volumen de fase móvil M-1; los interferentes menos retenidos (I1) se eliminan al desecho. Cuando el primer analito comienza a eluir de la columna C-1, se activa la válvula (HP-1) que actúa como interfase entre los dos sistemas CL, finalizando la etapa de purificación y comenzando la transferencia.

3) Transferencia (Figura 2C). La primera columna se coloca en línea con la segunda, y se utiliza un cierto volumen de fase móvil M-2 para eluir de la columna C-1 hacia la C-2 la fracción que contiene los compuestos de interés (A). Cuando el último analito ya ha sido transferido desde C-1 a C-2, se activa nuevamente la válvula, finalizando la transferencia.

4) Análisis y lavado (Figura 2D). Durante esta etapa la fracción transferida desde C-1 a C-2 se separa mediante la fase móvil M-2, siguiendo una CL convencional. Simultáneamente, la primera columna (C-1) vuelve a ser eluida por la fase móvil M-1 que eliminará los interferentes que muestran mayor retención (de cola). Si la fase móvil no es capaz de eluirlos completamente mientras tiene lugar la separación en C-2, se puede lavar la primera columna con un eluyente más fuerte, como metanol, acetonitrilo, etc. (M-1b), reacondicionándola posteriormente con M-1, antes de la próxima inyección.

Figura 2. Etapas de un procedimiento con acoplamiento CL-CL. (A) Inyección. (B) Purificación. (C) Transferencia. (D) Análisis.

C-1 y C-2 primera y segunda columna separadora; AS autoinyector, I1 e I2 interferentes de la muestra (de cabeza y de cola, respectivamente); A fracción de analito; P-1 y P-2 bombas CL; M-1 fase móvil para la purificación en C-1; M-2 fase móvil de C-2; HP-1 válvula de alta presión de 6 vías; D detector; W desecho.

Selección de las condiciones del acoplamiento.

Los dos parámetros más importantes que se han de optimizar en un procedimiento de acoplamiento CL-CL son (Hogendoorn et al., 1991a):

a) la selección de la primera columna separadora (C-1). Para el análisis por CL en fase reversa de pesticidas moderadamente polares son adecuadas columnas C18 de 15 x 3.2 mm d.i. Mediante un apropiado eluyente (M-1) suelen proporcionar suficiente separación entre interfentes (I1) y analitos (A) en la mayoría de aplicaciones.

b) la fuerza eluotrópica de la fase móvil utilizada en la purificación (M-1). Como ya se ha indicado, la elección de la fase móvil M-1 es crucial. Se debe llegar a una situación de compromiso, ya que por un lado, una fase móvil M-1 con una fuerza eluotrópica baja permitiría la inyección de volúmenes mayores de muestras acuosas sin un apreciable ensanchamiento de bandas, aunque restringiría la eliminación eficaz de los interferentes poco retenidos (I1). Mientras que, por otro lado, una fase móvil M-1 con una elevada fuerza eluotrópica mejoraría la resolución entre I1 y la fracción de analitos (A), pero disminuiría el tiempo de purificación. La mejora en la selectividad al emplear una fase móvil M-1, con una correcta fuerza eluotrópica para mejorar la etapa de purificación se ha demostrado en varias aplicaciones (Goewie y Hogendoorn, 1985, 1987a, 1987b).

Después de la elección de la columna C-1 y de la composición de la fase móvil M-1, las condiciones finales del acoplamiento CL-CL se pueden determinar fácilmente mediante dos experiencias:

1) Determinación del volumen de purificación. Este valor se puede determinar conectando directamente al detector la primera columna separadora (C-1) e inyectando el compuesto de interés que presente una menor retención con la fase móvil M-1 (A0). El volumen de ruptura que presente este analito en estas condiciones determinará el volumen máximo de purificación a aplicar en el método, representado en la figura como el área sombreada. (Figura 3).

Este volúmen de purificación debe chequearse rutinariamente para asegurarse de que se realiza la purificación de modo correcto, sin pérdidas del analito A0.

Figura 3. Representación esquemática del diseño para la determinación del volumen de purificación.

C-1 y C-2 primera y segunda columna separadora; AS autoinyector; A0 analito menos retenido en C-1; M-1 fase móvil para la purificación en C-1 (eliminación de I1); M-1b eluyente fuerte (eliminación de I2); M-2 fase móvil de C-2; HP válvula de alta presión de 6 vías; D detector.

2) Determinación del volumen de transferencia. Este valor se determina conectando directamente al detector la primera columna separadora (C-1) e inyectando el analito que presente una mayor retención (An), pero siendo eluido con la fase móvil M-2 que es la que realiza la transferencia. El volumen de ruptura que posea este analito en estas condiciones fijará el volumen máximo de transferencia a utilizar, representado en la figura como el área sombreada. (Figura 4)

Este volúmen de transferencia, también debe chequearse rutinariamente para que la transferencia se realice de modo correcto, sin pérdidas del analito An. Además, como ya se ha comentado anteriormente, interesa que esta fracción transferida desde C-1 hacia C-2 tenga el menor volumen posible, para minimizar el ensanchamiento de bandas y aumentar la sensibilidad.

Figura 4. Representación esquemática del diseño para la determinación del volumen de transferencia.

C-1 y C-2 primera y segunda columna separadora; AS autoinyector; An analito más retenido en C-1; M-1 fase móvil para la purificación en C-1 (eliminación de I1); M-1b eluyente fuerte (eliminación de I2); M-2 fase móvil de C-2; HP válvula de alta presión de 6 vías; D detector.

Ventajas y limitaciones del acoplamiento CL-CL.

Las ventajas más importantes del acoplamiento CL-CL ya se han comentado en puntos anteriores, y se pueden resumir como mejora de selectividad, aumento de sensibilidad y posibilidad de automatización, lo que hace que esta técnica tenga un gran futuro en ARP. Sin embargo, su mayor potencial no se encuentra en el desarrollo de MMR por las dificultades de obtener condiciones experimentales adecuadas para un amplio rango de compuestos. Su mayor campo de aplicación se encuentra en el análisis de compuestos "difíciles" como son pesticidas y otros contaminantes polares en muestras acuosas en las que resulta difícil o tedioso su aislamiento (preconcentración). Además, mediante la adecuada optimización de las condiciones se pueden llegar a inyectar grandes volúmenes de muestra si el analito presenta una buena retención sobre C-1 y eluye sin ensanchamiento de bandas. Así ocurre, por ejemplo, en el análisis de bentazona e isoproturon en muestras de aguas a niveles de 0.1 ppb, donde se inyectaron directamente mediante CL-CL, 2 y 4 ml de muestra, respectivamente (Hogendoorn y van Zoonen, 1992b; Hogendoorn et al., 1993b). Por consiguiente, otra ventaja adicional que presenta la CL de columnas acopladas es su gran capacidad de análisis, pudiéndose analizar un elevado número de muestras por día (sample throughput), del orden de 30-50, ya que en la mayoría de los casos el pretratamiento es mínimo y el análisis por CL muy rápido.

Por otro lado, una importante función adicional que realiza el acoplamiento CL-CL es la protección de la columna separadora principal (C-2) en aquellos casos donde no se aconseja una prefiltración de la muestra, ya que se pueden producir pérdidas de analitos durante la filtración, como en el análisis de dinitrofenoles en suelos (Hogendoorn, 1993a).

Para el análisis de muestras o extractos más limpios, con los que no se esperan problemas de obturación o de selectividad, se podría pensar en eliminar el acoplamiento CL-CL, pero, sin embargo, en muchos casos el uso del mismo es beneficioso al reducir el tiempo total de análisis, ya que ningún pico de interferente que eluya muy tarde (I2) se transfiere a la segunda columna separadora.

En cuanto a las limitaciones, cabe citar que, en comparación con los procedimientos "off-line", se debe realizar una inversión en equipamento y se requiere destreza y práctica habitual en procedimientos de CL para diseñar y aplicar el acoplamiento CL-CL. Probablemente es ésta la razón por la que todavía no se utiliza ampliamente esta técnica en ARP.

En segundo lugar, la primera columna debe ser muy estable, ya que la inyección de extractos de muestra sin purificar combinados con contínuas aplicaciones de disolventes de baja y elevada fuerza eluotrópica afecta a su vida media. Para la mayoría de las aplicaciones, es posible utilizar durante una semana contínuamente la misma columna sin apreciar una disminución de la selectividad.

Otro aspecto a tener en cuenta es la necesidad de realizar una comprobación, más o menos diaria, de los volúmenes de purificación y transferencia antes de procesar una nueva serie de muestras ya que, a que a pesar de la mejora en los rellenos C18, siempre existe una pequeña variación en la retención (disminución) observable a lo largo de un cierto período de utilización.

Aplicaciones del acoplamiento CL-CL.

Como ya se ha comentado anteriormente existen un gran número de referencias sobre el uso del acoplamiento PC-CL para llevar a cabo una etapa de enriquecimiento de los analitos, pero existen muy pocas sobre el uso del acoplamiento CL-CL.

Una de las primeras aplicaciones en las que se realiza una purificación en línea de la muestra mediante "column-switching" se debe a Goewie y Hogendoorn (1985). Se trata de la determinación de residuos del fungicida iprodiona en aguas superficiales. Después de una ELL con diclorometano, 2 ml del extracto obtenido se inyectan en la precolumna enriquecedora, la cual se lava posteriormente con 5 ml de CH3CN/H2O (20:80) antes de conectarla en línea con la columna separadora. Realmente es una aplicación PC-CL, con una etapa de lavado.
La primera aplicación real de acoplamiento CL-CL, en la que se introduce el concepto de purificación y transferencia de una fracción adecuada desde la precolumna hasta la columna separadora, se debe también a Goewie y Hogenddorn (1987a) y trata sobre la determinación de residuos de N-metilcarbamatos en muestras de alimentos. Los autores indican que es necesario realizar una buena purificación de la muestra ya que si se utiliza PC-CL convencional, aunque se realice un lavado de la precolumna, el cromatograma obtenido presenta numerosos picos interferentes, lo que obliga a un tiempo de análisis muy largo. Conociendo el orden de elución de los analitos (propoxur, carbofuran y carbaril) sobre fase reversa C18, se establece un volumen de purificación de 2.6 ml de CH3CN/H2O (5:95) antes de que el primer analito (propoxur) eluya de la precolumna de 15 ´ 3.2 mm de RP18, y un volumen de transferencia de 0.42 ml de CH3CN/H2O (35:65). Durante el análisis en la segunda columna (150 ´ 4.6 mm, Hypersil ODS 5 mm), se lava la precolumna con 4 ml de acetonitrilo, recondicionándose a continuación. Utilizando esta técnica, se alcazan límites de detección de 0.3 ppb en la muestra analizada.
Posteriormente, Goewie y Hogendoorn (1987b) también demostraron las ventajas del acoplamiento CL-CL frente al PC-CL, determinando residuos de los herbicidas bromacilo y diuron, así como el principal metabolito de este último, 3,4-dicloroanilina en muestras de agua subterránea. Tras una ELL con diclorometano, 100 ml del extracto se analizan mediante acoplamiento CL-CL con un volumen de purificación de 2.5 ml de MeOH/H2O (10:90) y un volumen de transferencia de 0.5 ml de MeOH/H2O (65:35), utilizando como C-1 una precolumna de 15 ´ 3.2 mm de RP18, y como C-2 una columna de 150 ´ 4.6 mm, Hypersil ODS 5 mm. Se realiza una comparación con la preconcentración mediante PC-CL de 50 ml de muestra, comprobándose la pérdida total de bromacilo y 3,4-dicloroanilina en estas condiciones, mientras que el diuron se recupera completamente aunque se ve fuertemente interferido en el cromatograma. Si se intenta introducir una etapa de lavado, tras la preconcentración, con MeOH/H2O (10:90), se pierde el 50% del diuron. Utilizando acoplamiento CL-CL, se obtienen unos límites de detección de 0.01 ppb para diuron, 0.02 ppb para 3,4-dicloroanilina y 0.2 ppb para bromacilo.
Hogendoorn y Goewie (1989b) determinan residuos de los herbicidas bentazona y cianazina en aguas superficiales mediante concentración por evaporación de 100 ml de agua hasta un volumen de 2 ml y posterior inyección de una alicuota de 100 ml en un sistema de CL con columnas acopladas. El volumen de purificación es de 4 ml de MeOH/tampón fosfato 0.03M, pH 2.7 (5:95) sobre una precolumna de 15 ´ 3.2 mm de RP18 de 7 mm, y el volumen de transferencia es 0.5 ml de MeOH/tampón fosfato 0.03M, pH 2.7 (35:65). Como C-2, utilizan una columna de 150 ´ 4.6 mm, Hypersil ODS 5 mm. Este procedimiento proporciona un límite de detección de 0.5 ppb. Modificando ligeramente el procedimiento de extracción, se alcanzaron niveles de 0.1 ppb.
A pesar de que, como ya se ha comentado, el acoplamiento CL-CL, por su selectividad inherente, parece menos apropiado para aplicaciones multirresiduales Hogendoorn y van Zoonen (1990a) han aplicado un procedimiento de CL con columnas acopladas a la determinación de nueve pesticidas polares (cloridazon, metoxuron, benazolina, bentazona, fenfuram, bromoxinilo, metabenztiazuron, ioxinilo y desmedifam) en muestras de cereales. 50 g de muestra se extraen por maceración con 100 ml de MeOH durante una noche. Tras la adición de 400 ml de agua acidificada, se realiza una ELL con diclorometano, se seca y evapora el extracto disolviéndose finalmente en 1 ml de MeOH/H2O (20:80). 50 ml de este extracto final se inyectan en una columna de 50 ´ 3 mm de C18, donde se lleva a cabo la etapa de purificación con 1.5 ml de MeOH/0.025M NaAc, 0.03M fosfato, pH 2.7 (25:75); la transferencia se realiza mediante un gradiente escalonado con MeOH/0.025M NaAc, 0.03M fosfato, pH 2.7, con un tiempo total de análisis de aproximadamente 25 min. Como se observa, en este caso se utiliza como C-1 una columna más larga, debido a la gran diferencia entre polaridades, lo que obliga a que ya empiece la separación en la primera columna y continúe durante la "transferencia" (en este caso durante 12 min) en la segunda (50 ´ 3 mm de C18, 5 mm), obligando a realizar elución con gradiente escalonado, debido a la gran diferencia de polaridades de los pesticidas estudiados. Utilizando este procedimiento, se alcanzaron límites de detección de 0.05 mg/kg.
Como ya hemos comentado, una posible aplicación de la CL con columnas acopladas sería el análisis rápido, sensible y selectivo de pesticidas o metabolitos "dificiles" por técnicas convencionales debido a su elevada polaridad y detección poco selectiva. Un ejemplo de estos compuestos sería el cloroalilalcohol (CAAL) metabolito del fumigante del suelo, 1,3-dicloropropeno. Hogendoorn et al (1990b) han propuesto un método para su determinación en muestras de aguas a niveles de 0.1 ppb mediante el uso de CL con columnas acopladas. Se inyectan directamente 200 ml de muestra en una columna C-1 de 50 mm rellena de C18 de 5 mm y se aplica un volumen de purificación de 1 ml de H2O, transfiriéndose a la segunda columna mediante 0.8 ml de MeOH/H2O (5:95), realizándose la detección UV a 205 nm. En estas condiciones, se obtiene un límite de detección de 1 ppb. Para alcanzar 0.1 ppb, se realiza una ELL con éter etílico, inyectándose 200 ml del extracto en el mismo sistema de columnas acopladas.
Baumann et al. (1991) comparan el uso de la CL con derivatización post-columna y el acoplamiento CL-CL en la determinación de residuos del fungicida ditiocarbámico tiram en manzanas. La extracción se realiza mediante maceración en acetato de etilo, el cual se concentra en rotavapor, obteniéndose finalmente un extracto en MeOH. 50 ml de este extracto final se analizan mediante CL con columnas acopladas, realizándose una purificación con 1.9 ml de CH3CN/NH4Ac 0.01M, pH 5 (40:60) sobre una columna de 50 ´ 4.6 mm rellena de Microspher C18 de 3 mm y posteriormente se transfiere la fracción de tiram a la segunda columna de 100 mm con 0.6 ml de CH3CN/NH4Ac 0.01M, pH 5 (70:30), realizándose la detección a 280 nm. El procedimiento CL-CL mejora en todos los sentidos al anteriormente propuesto basado en el uso de la CL con derivatización post-columna, en cuanto a límite de detección (0.01 mg/kg) y estabilidad de la respuesta.
Otro metabolito polar, aún más que el CAAL, es la etilentiourea (ETU), que se forma por degradación de los etilenbisditiocarbamatos. Hogendoorn et al. (1991b) presentan un método de columnas acopladas para la determinación de ETU en muestras acuosas a nivel de trazas. El procedimiento consiste en la inyección directa de 200 ml de agua (o de extracto) en una primera columna de 150 mm rellena de Hypersil ODS de 5 mm (se utiliza una columna de tal longitud debido a la elevada polaridad del analito), realizándose una purificación con 2.6 ml de H2O con un 1% de CH3CN y 0.2% de NH3. La transferencia a la segunda columna, idéntica a la primera, se realiza con 0.44 ml de la misma fase móvil. Inyectando directamente una muestra de agua, se obtiene un límite de detección de 1ppb, mientras que si se realiza una concentración por evaporación y posterior ELL con diclorometano en presencia de tiourea, se alcanzan limites de detección de 0.1 ppb. La detección se realiza mediante UV a 233 nm.
Así mismo, Hogendoorn y van Zoonen (1991c) analizan residuos de ETU en zumo de manzana utilizando el mismo procedimiento anterior de acoplamiento CL-CL, pero realizando una EFS C18 previa de 2 ml de muestra, que retiene los interferentes pero no el analito, que pasa rápidamente por el cartucho de 100 mg. 100 ml del extracto obtenido se analizan mediante el diseño anterior, con un volumen de purificación de 2.6 ml y un volumen de transferencia de 0.27 ml, aunque los flujos se mantienen ahora un poco más bajos (0.8 y 0.9 ml/min, respectivamente). El procedimiento permite alcanzar límites de deteccion de 0.01 mg/kg.
Continuando con otro metabolito polar, aunque no tanto como CAAL o ETU, Hogendoorn et al. (1992a) han desarrollado un método de acoplamiento CL-CL, en el que se introduce la posibilidad de inyectar grandes volúmenes de muestra para aumentar la sensibilidad del procedimiento cuando el analito presente poca respuesta al sistema de deteción, pero suficiente retención sobre fase reversa C18. El procedimiento se desarrolló para el análisis de residuos de metilisotiocianato (MITC), metabolito del fumigante metam sodio, así como del pesticida dazomet, en muestras de agua utilizando inyección directa de grandes volúmenes de muestra. Realizando una inyección directa de 770 ml de muestra, el procedimiento permite alcanzar límites de detección de 1 ppb. Para obtener una mejora en la sensibilidad, se debe realizar una ELL con isooctano seguida de un cambio de disolvente de isooctano a agua. Para ello, se utiliza un cartucho de EFS de sílicagel que retiene al analito, eluyendo finalmente con agua. Para llevar a cabo el acoplamiento CL-CL se utiliza una primera columna de 50 mm rellena de Microspher C18 de 3 mm, donde se inyectan 770 ml de muestra de agua o extracto y se purifica con 1.7 ml de CH3CN/H2O (40:60); la transferencia se realiza con 0.4 ml de CH3CN/H2O (50:50) hacia una segunda columna de 100 mm de longitud, utilizándose detección UV a 237 nm.
Se han desarrollado otras aplicaciones basadas en el acoplamiento CL-CL y en la inyección de grandes volúmenes de muestra para pesticidas polares con mejores características en cuanto a detección UV y retención sobre fase reversa C18, como son la bentazona y el isoproturon. Hogendoorn y van Zoonen (1992b) han desarrollado un procedimiento para la determinación de residuos del herbicida bentazona en aguas potables mediante inyección directa de 2 ml de muestra y detección UV a 220 nm. La muestra se acidifica con ácido fosfórico y se analiza mediante CL con columnas acopladas utilizando como C-1 una columna de 50 mm de C18 de 3 mm y un volumen de purificación de 4.7 ml de MeOH/0.1% H3PO4 (50:50). La transferencia se realiza con 0.5 ml de MeOH/0.1% H3PO4 (60:40) a una columna de 100 mm de C18 de 3 mm. El límite de detección del procedimiento es de 0.1 ppb con un tiempo total de análisis por muestra inferior a 10 min.
Así mismo, Hogendoorn et al. (1993b) también han desarrollado un procedimiento para la determinación de residuos del herbicida isoproturon en muestras de aguas potables, superficiales y subterráneas a nivel de 0.1 ppb mediante CL con columnas acopladas, inyección directa de 4 ml de muestra y detección UV a 244 nm. La muestra se analiza mediante CL con columnas acopladas utilizando como C-1 una columna de 50 mm de C18 de 3 mm y un volumen de purificación de 5.85 ml de CH3CN/H2O (47.5:52.5). La transferencia se realiza con 0.4 ml de la misma fase móvil a una columna de 100 mm de C18 de 3 mm.

Como conclusión, cabe indicar que la CL con columnas acopladas es una técnica adecuada para el análisis rápido de trazas de pesticidas polares en muestras de aguas. Según las características de estos pesticidas, tales como retención sobre fase reversa C18 y detectabilidad, se pueden alcanzar límites de detección próximos a 0.1ppb, e incluso inferiores, utilizando inyección directa de grandes volúmenes de muestra.